Анализ ИФА – что это такое, для чего и как проводится исследование? ИФА – иммуноферментный анализ крови: расшифровка Что такое реактивность ифа.

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод иммуноферментного анализа (ИФА). Метод ИФА является высокочувствительным и высокоспецифичным иммунодиагностическим методом, с помощью которого проводят качественное и количественное определение различных веществ, обладающих свойствами антигена, гаптена (неполноценного антигена) или антитела. Метод ИФА широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний человека и животных и может также применяться для подтверждения качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП).

Принцип метода заключается в реакции специфического взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса и последующей детекции полученного комплекса с помощью спектрофотометрии, хемилюминесценции и других адекватных методик. Детекция может быть как прямой (когда исследуемое вещество само обладает ферментативной активностью, либо оно помечено ферментной меткой), так и косвенной или непрямой (когда исследуемое вещество, связавшееся с иммобилизованными на твердой фазе антителами, инкубируется с антителами, меченными ферментом). Качественный анализ позволяет получить информацию о содержании антигена или антитела в исследуемом материале по принципу «есть/»нет». При проведении количественного анализа определяют концентрацию антигена или антитела в исследуемом материале с использованием калибровочного графика.

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Метод ИФА включает 3 основных этапа: 1) образование иммунного комплекса «антиген (исследуемое вещество) – специфическое к нему антитело» или наоборот; 2) формирование связи конъюгата с образовавшимся на предыдущем этапе иммунным комплексом или со свободными местами связывания (детерминантами); 3) преобразование субстрата под действием ферментной метки в регистрируемый сигнал в результате биохимической реакции.

Все методики выполнения иммуноферментного анализа классифицируются как гомогенные или гетерогенные.

Методики, в которых все 3 стадии ИФА проходят в растворе, и между основными стадиями нет дополнительных этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов, относятся к группе гомогенных методов ИФА. В основе гомогенного ИФА, применяемого, как правило, для определения низкомолекулярных субстанций, лежит процесс ингибирования активности фермента при его соединении с антигеном или антителом. В результате реакции антиген–антитело активность фермента восстанавливается. При образовании иммунного комплекса антиген–антитело, содержащего ферментную метку, происходит ингибирование активности фермента на 95 % по отношению к высокомолекулярному субстрату, что обусловлено стерическим исключением субстрата из активного центра фермента. По мере увеличения концентрации антигена происходит связывание все больше антител, и сохраняется все больше свободных конъюгатов «антиген–фермент», способных гидролизовать высокомолекулярный субстрат. Гомогенный метод ИФА проводится очень быстро. На анализ одного определения требуется 1 мин. Чувствительность метода достаточно высока. С его помощью можно определить вещество на уровне пикомолей.

Для гетерогенных методов характерно проведение анализа в двухфазной системе с участием твердой фазы – носителя и обязательна стадия разделения иммунных комплексов от непрореагировавших компонентов (отмывка), которые находятся в разных фазах (образовавшиеся иммунные комплексы находятся на твердой фазе, а непрореагировавшие комплексы – в растворе). Гетерогенные методы, в которых формирование иммунных комплексов на первой стадии протекает на твердой фазе, называют твердофазными методами.

Методы относятся к гомогенно-гетерогенным, если 1 стадия – образование специфических комплексов – происходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу с иммобилизированным реагентом.

Метод гетерогенного ИФА состоит из 3 основных этапов:

• иммобилизация антигена или антитела на твердой фазе, полученный комплекс называется иммуносорбентом;
• удаление несвязавшегося реагента и блокирование сайтов связывания на твердой подложке с помощью блокирующих белков, таких, например, как альбумин, казеин; инкубация анализируемого препарата с иммуносорбентом для того, чтобы произошло их связывание;

3) детекция благодаря ферментативной активности самого исследуемого вещества или благодаря связанной с анализируемым препаратом ферментативной метке (прямой вариант). В некоторых случаях производится дополнительная инкубация комплекса «иммуносорбент–исследуемое вещество» с вторичными антителами, конъюгированными с ферментативной меткой (непрямой вариант).

Количественное определение исследуемого вещества осуществляется путем добавления подходящего для используемого детектора субстрата и сравнения сигнала исследуемого вещества со стандартным образцом.

Метод гетерогенного ИФА подразделяют на неконкурентный ИФА и конкурентный ИФА. Схемы анализа могут быть модифицированы в процессе разработки лекарственного препарата в соответствии с необходимыми требованиями. Изменения должны быть указаны в фармакопейной статье или нормативной документации. Выбор способа постановки ИФА зависит от природы исследуемого вещества и его количества, так как разные виды ИФА обладают различной чувствительностью. Для оценки качества веществ, содержащих антитела, возможно использование специфичных антиидиотипических антител.

Неконкуретный метод ИФА

Неконкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).

Прямой вариант ИФА

Может выполняться 2 способами. В первом случае исследуемое вещество (антиген) непосредственно иммобилизовано на твердой фазе; тогда связавшееся с антигеном меченое антитело является детектором. При выполнении теста иным способом используют иммобилизованные на твердой фазе антитела. В этом случае детектором является исследуемое вещество, меченное ферментом.

Косвенный (непрямой) вариант ИФА

При выполнении непрямого варианта ИФА антиген иммобилизован на твердой фазе. После блокировки к антигену прибавляют раствор специфических к нему антител. После инкубации образовавшийся комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшихся антител и добавляют меченный ферментом анти-иммуноглобулин (анти-Ig), выступающий в роли детектора. Анти-Ig детекторы коммерчески доступны для конкретных классов и подклассов Ig, что делает этот формат анализа удобным для изотипирования антител. Кроме того, использование меченого анти-Ig усиливает сигнал по сравнению с прямым методом иммуноферментного анализа, тем самым увеличивая чувствительность анализа.

Метод «сэндвича» как вариант постановки ИФА

Наиболее распространенным неконкурентным методом является «сэндвич» метод. При его выполнении на твердой фазе иммобилизуют первичные антитела с их последующей блокировкой. Затем к ним прибавляют исследуемое вещество, содержащее антиген, и инкубируют. После инкубации комплекс антиген–антитело отмывают от несвязавшегося антигена и добавляют вторичные антитела, меченные ферментом, и проводят детекцию.

Конкурентный метод ИФА

Конкурентный метод ИФА подразделяется на несколько видов: по типу детекции (прямой конкурентный, косвенный (непрямой) конкурентный) и по типу иммобилизованного на твердой фазе вещества (антиген или антитело).

Прямой конкурентный вариант ИФА

Для обнаружения или количественного определения растворимых антигенов применяют прямой конкурентный вариант ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном. Для этого используют антиген-специфические антитела, конъюгированные с соответствующим детектором (например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, рутений или флуоресцеин). На твердую фазу иммобилизуют стандартный антиген с последующей блокировкой. Конъюгированное с ферментативной меткой антитело инкубируют с исследуемым веществом (растворимым антигеном). Затем эту смесь добавляют к иммобилизованному антигену, инкубируют, а потом отмывают от несвязавшегося комплекса антиген–антитело. Следующий шаг заключается в добавлении подходящего субстрата для используемого в качестве метки фермента. Ингибирование реакции, обусловленное наличием 2 антигенов в системе, по сравнению с контрольным образцом без конкурентного растворимого антигена, является обратно пропорциональным значению количества исследуемого вещества.

Выполнение прямого конкурентного варианта ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антителом аналогично прямому конкурентному ИФА с иммобилизованным на твердой фазе антигеном, однако используется для обнаружения или количественного определения антител.

Косвенный (непрямой) конкурентный вариант ИФА

Этот способ постановки ИФА аналогичен прямому конкурентному варианту, однако вместо меченого антитела или антигена при детекции используется меченый анти-Ig реагент или меченые вторичные антитела, соответственно.

Общие условия проведения метода ИФА

В качестве твердой фазы для проведения иммуноферментного анализа применяют различные материалы: силикон, нитроцеллюлоза, полиамиды, полистирол, поливинилхлорид, полипропилен, акрил и другие. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и другие планшеты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки. От выбора твердой фазы зависит принцип иммобилизации (гидрофобное, гидрофильное, ковалентное взаимодействие). Чаще других в качестве твердой фазы используют 96-луночные пластиковые планшеты для микротитрования. Количество лунок в планшете может варьироваться. Планшет может быть прозрачным (колориметрическая детекция) и матовым (хемилюминесцентная детекция, флуориметрия).

Иммобилизацию необходимо проводить без пузырьков воздуха в лунке, так как их присутствие изменяет показание оптической плотности. Возможно использование биотинилированных иммобилизованных реагентов. В этом случае в реакции используют стрептавидин и биотинилированную ферментативную метку. Данный метод используется для усиления сигнала. Время и температура иммобилизации, зависящие от кинетической природы, стабильности и концентрации реагента, должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.

Все стадии иммуноферментного анализа, промывочные и блокирующие растворы, временные промежутки и температурные условия для каждой стадии, количество оборотов в минуту для инкубации на шейкере, условия детекции также должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.

Примеры методик для некоторых видов ИФА

Косвенный неконкурентный метод ИФА

1. Сорбция антигена. В каждую лунку 96-луночного планшета вносят 0,1-0,5 мкг антигена и 100 мкл 0,05 М карбонат-бикарбонатного буферного раствора (рН 9,6), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации, и далее проводят сорбцию при температуре 4 О С в течение 16 ч. Возможно использование других буферных растворов с высокими значениями pH. Инкубация проводится при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка (двукратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20 (по 300 мкл на лунку), если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.

1. Блокировка. Для блокирования мест неспецифического связывания антигенов или антител лунки планшета заполняют фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0) или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации, содержащим 1% раствор бычьего сывороточного альбумина или других белков (казеина, желатина, сухого молока и др.), и инкубируют в течение 10–15 мин при комнатной температуре (если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации).

III. Титрование специфических антител. При необходимости количественной оценки исследуемое вещество (антиген или антитело) титруют в серийных разведениях параллельно со стандартным образцом (СО).

Титрование можно проводить как в горизонтальных, так и в вертикальных рядах планшета. Необходимо отметить, что титрование антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить их титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных антител (сыворотки) разведение.

При титровании в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител – в среднем 1–10 мкг на лунку, далее производят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфическими антителами проводят в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора pH 9,0, содержащего 0,1% твин-20.

1. Добавление антивидовых (антиглобулиновых) антител, конъюгированных с ферментной меткой. В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с ферментативной меткой. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc- фрагментам специфических антител. Концентрация детекторных антител, как правило, указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000).

Инкубация с вторичными мечеными антителами проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20.

Инкубация проводится в течение 10 мин при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

1. В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Для остановки ферментативной реакции применяют «стоп реагент», который добавляют во все исследуемые и контрольные пробы в равных количествах. Наиболее часто в качестве «стоп реагента» применяют серную кислоту.

Прямой неконкурентный метод ИФА

Методика прямого ИФА имеет лишь небольшие отличия от методики непрямого неконкурентного ИФА. Так, I и II стадии одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте ИФА на стадии III используют специфические исследуемому антигену антитела, конъюгированные с ферментной меткой, и они прямо взаимодействуют с исследуемым веществом. При необходимости также можно проводить титрование конъюгатов аналогично принципу, описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV в рамках прямого неконкурентного ИФА не проводится.

«Сэндвич» метод ИФА

В данном варианте ИФА используется пара антител (первичные и вторичные), специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

1. Сорбция антител на твердой фазе. Методика сорбции антигена аналогична методике сорбции антител в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».
2. Блокировка. Методика блокировки мест неспецифического связывания на подложке (твердой фазе) аналогична методике блокировки, описанной в разделе «Косвенный неконкурентный метод ИФА».

III. Инкубация с антигеном. В лунки планшета с преадсорбированными антителами вносят по 50 мкл исследуемого вещества и стандартных разведений антигена, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, поскольку твин-20 снижает неспецифическое связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемое вещество, и стандартные разведения антигена вносят попарно в соседние в горизонтальном ряду лунки (либо по 3 повторности), используя по 2 (3) лунки на каждое разведение белка.

Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз фосфатно-солевым буферным раствором (pH 9,0), содержащим 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.

1. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфических антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител, как правило, указывается в фармакопейной статье или нормативной документации (обычно используют концентрацию 2–4 мкг/мл).

Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

Отмывка осуществляется не менее 3–4 раз с помощью фосфатно-солевого буферного раствора (pH 9,0), содержащего 0,1 % твин-20, или другим буферным раствором, указанным в фармакопейной статье или нормативной документации.

1. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта. Методика проведения ферментативной реакции аналогична методике, описанной в разделе: «Косвенный неконкурентный метод ИФА».

Детекция

Как было указано выше, для детекции используются меченные ферментной меткой или другим реагентом антитела. В качестве ферментной метки могут выступать, например, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза или галактозидаза. В качестве детектора могут быть использованы антитела или антигены с другими метками. Выбор реагента-детектора зависит от типа метки, конъюгированной с антителом или антигеном и способа детекции.

В качестве методов детекции могут быть использованы спектрофотометрия, хемилюминесценция, флуориметрия и другие методы, исходя из выбора метки.

Результаты количественного метода ИФА

Результаты количественного метода ИФА рассчитывают по линейной калибровочной кривой с обратной регрессией или с помощью комплексного метода, использующего нелинейную калибровочную кривую с обратной регрессией. Методика интерпретации результатов зависит от используемого способа постановки ИФА. Например, по результатам испытания с помощью калибровочной кривой можно оценивать концентрацию неизвестного образца, проводить оценку полумаксимальной концентрации ингибирования или эффективной концентрации. Это позволяет определять количество исследуемого вещества или его активность в сравнении с эталонным/калибровочным стандартным образцом (СО). Обычно вид калибровочной кривой при выполнении количественного метода ИФА, характеризующий концентрацию анализируемого препарата, зависит от рассчитанного среднего значения нелинейно. В связи с этим, рекомендуется использовать различные математические модели для анализа полученной кривой. В остальных случаях метод ИФА используют как качественный метод, позволяющий оценить наличие того или иного исследуемого вещества в пробе в пределах чувствительности методики.

Примечание.

Приготовление карбонат-бикарбонатного буферного раствора (pH 9,6). В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 1,59 г натрия карбоната (безводного) или 4,29 г натрия карбоната 10-водного и 2,93 г натрия гидрокарбоната, растворяют в 800 мл воды очищенной, доводят pH до 9,6, перемешивают, далее доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

Для проведения комплексной оценки состояния организма применяется ИФА-метод проведения диагностики. Иммуноферментный анализ крови предназначен для диагностирования инфекционных, гематологических, первичных и вторичных иммунодефицитов.

Что такое анализ ИФА

Многие пациенты интересуются методом ИФА: что это, для чего проводится исследование. Иммуноферментный анализ начал использоваться сравнительно недавно. Изначально с его помощью изучались антигенные структуры, и он проводился только в научных целях. Затем ученые пришли к выводу, что при помощи ферментов можно выявить специфические антитела, возникающие в ответ на протекающее заболевание.

Изначально эта методика применялась только узкопрофильными медицинскими учреждениями, в основном на станциях переливания крови. Особое значение имеет метод ИФА для выявления ВИЧ-инфекции.

На сегодняшний день этот метод имеет широкую сферу применения. Современные лаборатории используют его для диагностирования:

• опухолей;
• гормональных нарушений;
• инфекций;
• хронических или перенесенных ранее инфекционных процессов;
• гельминтов.

Если в организме протекает инфекционный процесс, то этот вид диагностики считается наиболее оптимальным для определения типа заболевания.

Суть метода и его виды

Метод ИФА - что это, какова суть этого вида исследования? Этот и многие другие вопросы интересуют пациентов. Основой этого способа диагностики считается связывание иммунных клеток организма с антигенами возбудителей инфекции. Получившийся комплекс определяют при помощи специального фермента.

Чтобы понять принцип метода ИФА, нужно знать, как проходит реакция антиген-антитело. Антиген - чужеродная для организма молекула белкового происхождения, которая проникает вместе с инфекцией. Частички чужой крови, несовпадающие по группе, также считаются антигенами. В организме они провоцируют иммунную реакцию, направленную на защиту от чужеродных веществ. Поэтому тело человека вырабатывает антитела - иммуноглобулины, способные присоединяться к антигенам, образуя иммунный комплекс. Такие соединения намного легче распознаются и уничтожаются клетками иммунитета.

Реакцию на наличие таких иммунных комплексов проводят в лабораторных условиях, применяя уже готовые соединения, чтобы определить, есть ли в крови подобные им.

Суть метода ИФА достаточно простая, однако из-за того, что анализ крови проводится для выявления многих инфекций и болезней, существует несколько его разновидностей. Каждый отличается схемой проведения и областью применения. Может быть прямой или непрямой ИФА. Прямой метод подразумевает под собой то, что применяются обездвиженные антитела, реагирующие с антигенами. Основным плюсом такого метода является то, что все процессы можно автоматизировать, а значит, диагностика занимает немного времени.

Непрямой метод подразумевает, что применяются антитела вторичного характера. А на твердой фазе обездвиживается антиген. Анализ позволяет определить антитела к различным антигенам. Это помогает достигнуть более точного результата, однако метод отличается сложностью.

Преимущества исследования

Методом ИФА имеют множество преимуществ в сравнении с другими способами диагностики. К основным можно отнести такие:

• высокая чувствительность;
• стабильность при хранении ингредиентов;
• скорость проведения диагностики;
• можно применять небольшое количество исследуемого материала;
• есть возможность автоматизации всех процессов;
• можно выявить инфекцию на самых ранних стадиях.

Этот метод диагностики универсальный, поэтому подходит для проведения массового обследования. При помощи анализа есть возможность проследить динамику протекания инфекционного процесса.

Показания для анализа и забор материала

Проведение исследования при помощи метода ИФА могут назначить при подозрении на множество болезней:

На наличие антител исследуется венозная кровь. Перед проведением анализа из нее выделяют элементы, которые могут осложнять исследование. Может проводиться забор и других биологических жидкостей.

Чтобы получить наиболее точную информацию, забор крови проводится на голодный желудок. Если процедура была назначена для определения скрытой инфекции, то за несколько недель до проведения анализа нужно прекратить принимать антибактериальные и противовирусные препараты. В зависимости от оснащенности лаборатории, где проводился забор материала, результат можно получить в течение суток. В экстренных случаях это время сокращается до нескольких часов.

Анализ на сифилис

Использование метода ИФА помогает определить наличие многих инфекций в организме, в частности и сифилиса. Для проведения исследования берется кровь из вены натощак. Затем осуществляется исследование, помогающее определить не только наличие болезни в организме, но и точные сроки ее начала, так как в течение болезни одни антитела заменяются другими в строго определенном порядке.

При острой фазе, свидетельствующей о продолжительном течении болезни, или при обострении хронической инфекции в крови будут обнаружены иммуноглобулины типа M. Наличие иммуноглобулинов типа A свидетельствует о том, что инфекция обитает в организме более 4 недель. Иммуноглобулины группы G говорят о разгаре болезни или о ранее проведенной терапии.

По степени окраса лунок оценивают интенсивность протекания инфекционного процесса, так как его насыщенность зависит от количества образовавшихся иммунных комплексов.

Анализ на ВИЧ-инфекцию

ИФА-метод применяется и для проведения анализа на в таком случае имеет определенные особенности, которые связаны с протеканием и прогрессированием болезни. Этот метод исследования считается наиболее приемлемым для определения, однако проводить его нужно не ранее чем через месяц после воздействия факторов риска. Это связано с наличием инкубационного периода, протекающего от 45 дней и до 6 месяцев. Именно поэтому анализ нужно повторить через полгода.

• аскаридоз;
• лямблиоз;
• токсоплазмоз и др.

Несмотря на все преимущества, существуют также недостатки метода ИФА. Основным недостатком считается то, что при проведении исследования доктор должен заранее иметь предположение о заболевании.

При нет возможности случайно найти возбудителя и определить его иммуноферментные свойства. Тест только указывает на наличие антител в крови больного. Кроме того, это достаточно дорогостоящий анализ.

Расшифровка анализа

Результатом качественного ИФА будет либо наличие антител, либо их отсутствие в крови. Если проводится количественный анализ, то концентрация антител может выражаться или в цифровом значении, или в определенным количеством знаков +.

Кроме того, анализируются такие показатели, как:

Показатель IgM указывает на протекание острого инфекционного процесса в организме. Полное его отсутствие может говорить об отсутствии возбудителя болезни или переходе ее в хроническую стадию.

Показатель IgA при отрицательном результате теста на IgM говорит о хронической или скрытой инфекции. Одновременное присутствие IgM и IgA свидетельствует о том, что болезнь находится в острой стадии. Наличие IgG говорит о переходе болезни в хроническую стадию или о полном выздоровлении и выработке иммунитета.

Сейчас существуют специальные тесты ИФА, которые можно провести самостоятельно.

В онлайн-лаборатории Lab4U мы хотим, чтобы каждый из вас мог заботиться о своем здоровье. Для этого мы просто и понятно рассказываем о показателях организма.

В онлайн-лаборатории Lab4U делаются серологические исследования для обнаружения антигенов возбудителя и специфических антител к ним - это самый точный метод диагностики инфекционных заболеваний. «Зачем надо сдавать анализ на антитела для диагностики инфекций?». Такой вопрос может возникнуть после направления врача в лабораторию. Попробуем на него ответить.

Содержание

Что такое антитела? И как расшифровать результаты анализа?

Антитела - это белки, которые иммунная система вырабатывает в ответ на проникновение инфекции. В лабораторной диагностике именно антитела служат маркером проникновения инфекции. Общим правилом подготовки к анализу на антитела является сдавать кровь из вены натощак (после приема пищи должно пройти не менее четырех часов). В современной лаборатории сыворотку крови исследуют на автоматическом анализаторе с использованием соответствующих реагентов. Иногда серологический анализ на антитела является единственным способом диагностики инфекционных заболеваний.

Анализы на инфекции могут быть качественными (дают ответ, есть ли инфекция в крови) и количественными (показывают уровень содержания антител в крови). Норма антител для каждой инфекции своя (для некоторых их не должно быть совсем). Референсные значения (показатели нормы) антител можно получить с результатом анализа.
В онлайн-лаборатории Lab4U можно сдать за один раз и

Различные классы антител IgG, IgM, IgA

Иммуноферментный анализ определяет антитела инфекций относящиеся к различным классам Ig (G, A, M). Антитела к вирусу, при наличии инфекции, определяются на очень ранней стадии, что обеспечивает эффективную диагностику и контроль течения заболеваний. Самые распространенные методы диагностики инфекций - это тесты на антитела класса IgM (острая фаза течения инфекции) и антитела класса IgG (устойчивый иммунитет к инфекции). Эти антитела определяют для большинства инфекций.

Однако, один из самых распространенных анализов - не дифференцирует тип антител, поскольку наличие антител к вирусам данных инфекций автоматически предполагает хроническое течение заболеваний и является противопоказанием, например, для серьезных хирургических вмешательств. Поэтому важно опровергнуть или подтвердить диагноз.

Детальную диагностику типа и количества антител при диагностированном заболевании можно сделать, сдав анализ на каждую конкретную инфекцию и тип антител. Первичная инфекция выявляется при обнаружении диагностически значимого уровня антител IgM в образце крови или значимым ростом числа антител IgA или IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 1-4 недели.

Реинфекция, или повторная инфекция, выявляется быстрым подъемом уровня антител IgA или IgG. Антитела IgA имеют более высокую концентрацию у пациентов старшего возраста и более точно диагностируют текущую инфекцию у взрослых.

Перенесенная инфекция в крови определяется как повышенные антитела IgG без роста их концентрации в парных образцах, взятых с интервалом 2 недели. При этом отсутствуют антитела классов IgM и А.

Антитела IgM

Их концентрация повышается вскоре после заболевания. Антитела IgM определяются уже через 5 дней после его начала и достигают пика в промежутке от одной до четырех недель, затем снижаются до диагностически незначительных уровней в течение нескольких месяцев даже без проведенного лечения. Однако, для полной диагностики недостаточно определения только антител класса М: отсутствие этого класса антител еще не говорит об отсутствии заболевания. Острой формы заболевания нет, но может быть хроническая.

Антитела IgM имеют большое значение в диагностике и детских инфекций (краснуха, коклюш, ветрянка), легко передающихся воздушно-капельным путем, так как важно как можно раньше выявить заболевание и изолировать заболевшего.

Антитела IgG

Основная роль антител IgG - это длительная защита организма от большинства бактерий и вирусов - хотя их выработка происходит более медленно, но ответ на антигенный раздражитель сохраняется более устойчивым, чем у антител класса IgM.

Уровни антител IgG повышаются медленнее (через 15-20 дней после начала заболевания), чем IgM, но остаются повышенными дольше, поэтому могут показывать давно текущую инфекцию при отсутствии IgM АТ. IgG могут находиться на низком уровне в течение многих лет, но, при повторном воздействии того же антигена, уровень антител IgG быстро повышается.

Для полной диагностической картины необходимо определить антитела IgA и IgG одновременно. При неясном результате IgA, подтверждение осуществляется определением IgM. В случае положительного результата и для точной диагностики второй анализ, сделанный через 8-14 дней после первого, должен быть проверен параллельно для определения роста концентрации IgG. Результаты анализа должны интерпретироваться в комплексе с информацией, полученной в других диагностических процедурах.

Антитела IgG, в частности, используются для диагностики - одной из причин язвы и гастрита.

Антитела IgA

В сыворотке появляются через 10-14 дней после начала заболевания, и вначале их даже можно обнаружить в семенной и вагинальной жидкостях. Уровень антител IgA обычно снижается к 2-4 месяцу после инфицирования в случае успешного лечения. При повторном инфицировании уровень антител IgA вновь возрастает. Если уровень IgA не падает после проведенного лечения, то это - признак хронической формы инфекции.

Анализ на антитела в диагностике TORCH-инфекций

Аббревиатура TORCH появилась в 70-х годах прошлого столетия, и состоит из заглавных букв латинских названий группы инфекций, отличительной особенностью которых является то, что при относительной безопасности для детей и взрослых, TORCH инфекции при беременности представляют чрезвычайную опасность.

Нередко, заражение женщины инфекциями TORCH-комплекса во время беременности (наличие в крови только антител IgM) является показанием для ее прерывания.

В заключение

Иногда, обнаружив в результатах анализа антитела IgG, например, токсоплазмоза или герпеса, пациенты приходят в панику, не посмотрев на то, что антитела IgM, которые показывают наличие текущей инфекции, могут отсутствовать вовсе. В этом случае анализ говорит о перенесенной ранее инфекции, к которой выработался иммунитет.

В любом случае, интерпретацию результатов анализа лучше доверить врачу, и с ним же в случае необходимости определиться с тактикой лечения. А сдать анализы вы можете доверить нам.

Почему быстрее, удобнее и выгоднее сдавать анализы в Lab4U?

Вам не нужно долго ждать в регистратуре

Все оформление и оплата заказа происходит онлайн за 2 минуты.

Путь до медцентра не займет более 20 минут

Наша сеть вторая по величине в Москве, а еще мы есть в 23 городах России.

Сумма чека не шокирует вас

Постоянная скидка в 50% действует на большинство наших анализов.

Вам не придется приходить минута-в-минуту или ждать в очереди

Сдача анализа происходит по записи в удобный промежуток времени, например с 19 до 20.

Вам не придется долго ждать результатов или ходить за ними в лабораторию

Мы пришлем их на эл. почту в момент готовности.

В диагностике вирусных болезней человека и животных широко применяют методы, основанные на использовании ферментов в качестве метки антигенов и антител. Это группа методов носит название иммуноферментного анализа.

ИФА применяют в двух вариантах: гистохимическом и твердофазном.

Гистохимический вариант ИФА, или иммунопероксидазную реакцию, используют редко. Он аналогичен методу иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки реакции используют антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом.

Для метки антител обычно применяют ферменты: пероксидазу хрена (чаще), щелочную фосфатазу, галактозидазу и др.

Таким образом, в комплекс антиген + антитело включаются антитела, меченные ферментом, и для обнаружения этого комплекса вносят субстрат (фермент-чувствительное вещество), которое под действием фермента разлагается, образуя цветной продукт ферментативной реакции, хорошо видимый в световом микроскопе.

В качестве субстрата используют ортофенилендиамин, 5-аминосалициловую кислоту или бензидин. К ним добавляют пероксид водорода (Н 2 O 2).

Материалом для выявления вирусных антигенов при этом варианте могут быть: мазки; отпечатки различных органов; парафиновые срезы; культуры клеток. При этом можно использовать как прямой, так и непрямой метод.

Прямой метод . На фиксированный препарат наносят конъюгат (антитела к предполагаемому вирусу, меченные ферментом), выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, затем препарат отмывают физиологическим раствором от несвязанного конъюгата, подсушивают на воздухе, наносят несколько капель раствора субстрата, инкубируют 5- 10 мин и промывают физиологическим раствором. Затем споласкивают дистиллированной водой, и результат учитывают с помощью светового микроскопа. В положительных случаях, т. е. при наличии антигена в исследуемом материале, видны или диффузное желто-коричневое окрашивание, или гранулы коричнево-черного цвета. В контрольных препаратах окрашивания не обнаруживают.

Непрямой метод . На фиксированный препарат наносят специфическую к предполагаемому вирусу сыворотку, выдерживают при 37 °С в течение 1-2 ч во влажной камере, промывают физиологическим раствором, подсушивают на воздухе и наносят меченную ферментом антивидовую сыворотку, выдерживают при 37 °С 1-6 ч. Далее следует процедура, как в прямом методе.

Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФИФА, РЭМА - реакция энзиммеченых антител, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay) в последние годы широко используют в биологии, в том числе и в вирусологии. Характерная особенность метода в том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) фиксируют на твердом носителе. В качестве носителей используют полистироловые микропанели, шарики, палочки и др.

Этим методом можно обнаружить и идентифицировать антиген, а также выявить антитела и определить их титр в сыворотках крови.

Существует много вариантов метода. Наиболее часто для обнаружения антигенов используют прямой метод («сандвич»-метод). Для этого специфические к предполагаемому антигену антитела фиксируют в лунках микропанелей, в которые вносят исследуемый антиген и выдерживают при 37 °С 1-2 ч. Затем микропанели промывают буферным раствором и вносят в лунки меченные ферментом к предполагаемому антигену антитела, выдерживают при 37 °С 1-2 ч, промывают микропанели, вносят раствор субстрата и выдерживают 5-30 мин. Реакцию останавливают добавлением раствора серной кислоты и учитывают визуально по разности в окраске опытных и контрольных образцов или при помощи спектрофотометрии. Положительные образцы имеют окраску от желтой до оранжево-коричневой.

Обнаружение и определение титра антител проводят непрямым твердофазным методом.

В крупных диагностических лабораториях применяют полностью автоматизированные установки для проведения твердофазного ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.

Достоинства ИФА: высокая чувствительность; специфичность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов; не требуется специальных приборов; оценку можно проводить визуально; возможность автоматизации, что позволяет его применять для массовых исследований; исследуемые сыворотки не требуют предварительной обработки. Это - экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Наиболее часто на практике используются три варианта твердофазного иммуноанализа - непрямой иммуноанализ, прямой иммуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Различия между этими типами иммуноанализа заключаются в следующем. В непрямом варианте иммуноанализа на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (Рис. 1А). В прямом варианте иммунанализа детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой (Рис. 1Б). В иммуноанализе сэндвич-типа на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой (Рис. 1В). Использование в иммуноанализе сэндвич-типа антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

Рис. 1. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа сэндвич-типа (В)

Непрямой иммуноферментный анализ (indirect ELISA)

Метод непрямого иммуноанализа характеризуется осуществлением 3-х стадийного процесса, на первой стадии которого антиген адсорбируется на специально подготовленном пластике, на второй с антигеном взаимодействуют специфичные к нему антитела, а на третьей в систему вводят антивидовые антитела, конъюгированные с ферментом, обуславливающим проведение индикаторной ферментативной реакции. В данной методике в качестве фермента используют пероксидазу хрена. Реакция проводится в специальных 96-луночных планшетах.

I. Сорбция антигена

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антиген 0,1-0,5 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0.1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифического связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Раститровка специфичных антител

Раститровку можно проводить как по горизонтальным, так и по вертикальным рядам планшета. Необходимо отметить, что раститровка антител проводится в том случае, если необходимо подобрать оптимальную концентрацию антител или определить титр. В том случае, если оптимальная концентрация и/или титр антител определены, то используют рекомендованное для данных конкретных антител разведение.

При раститровке в первую лунку ряда вносят готовое разведение антител - в среднем 1-10 мкг в лунку, далее проводят последовательное разведение антител в лунках. Инкубацию со специфичными антителами проводят в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 3 раза.

IV. Добавление антивидовых антител, конъюгированных с ферментной меткой

В качестве детекторных (вторичных) антител используются антивидовые поликлональные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена. Чаще всего используются козьи или кроличьи антитела, специфичные к целой молекуле или к Fc-фрагментам специфичных антител. Концентрация детекторных антител как правило указывается производителем в виде разведения исходного раствора (например, 1:1000). Инкубация со вторичными антителами проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

Пероксидаза хрена катализирует реакцию окисления субстрата перекисью водорода. В качестве субстрата пероксидазы хрена используется о-фенилендиамин (ОФД). В результате прохождения реакции образуется окрашенный продукт окисления ОФД.

Раствор субстрата: К 10 мл субстратного буфера (0,1 М Na-цитратный буфер, рН 4,5) добавить 0,01 мл 30% перекиси водорода и 0,2 мл 50х раствора ОФД (340 мг ОФД в 10 мл этилового спирта; хранить при –20°С).

Инкубация проводится в течение 10 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов.

V. Остановка ферментативной реакции

VI. Измерение оптической плотности

Прямой иммуноферментный анализ (direct ELISA)

Методика прямого иммуноанализа имеет лишь небольшие отличия по сравнению с методикой непрямого иммуноанализа. Так, стадии I и II одинаковы в обоих типах анализа. Отличие заключается в том, что в прямом варианте иммуноанализа на стадии III используют специфичные антитела, конъюгированные с ферментной меткой. При необходимости также можно проводить раститровку специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой, аналогично описанному ранее для неконъюгированных антител. Стадия IV опускается, а дальнейшие стадии (V-VII) проводятся аналогично описанному выше для непрямого варианта иммуноанализа.

Иммуноанализ сэндвич-типа (Sandwich-type immunoassay)

Рис. 2. Схематическое изображение иммуноанализа «сэндвич»-типа. АТп - антитело подложки, АТд - детекторное антитело, АГ - антиген, М - метка, ковалентно связанная с детекторным антителом, П - подложка, на которую сорбируется антитело подложки.

В данном варианте иммуноанализа (Рис.2) используется пара антител, специфичных к пространственно удаленным эпитопам исследуемого антигена.

I. Сорбция антител подложки

В лунки 96-луночного планшета для проведения иммуноанализа сорбируют антитела подложки 1-2 мкг в лунку в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS). Инкубация проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка (2-х кратная) несвязавшихся молекул антигена осуществляется фосфатно-солевым буфером содержащим 0,1% Tween-20 (PBSТ).

II. Блокировка

Для блокирования мест неспецифичного связывания лунки планшета заполняют PBST и инкубируют в течение 10-15 минут при комнатной температуре.

III. Инкубация с антигеном

В лунки планшета с преадсорбироваными антителами вносят по 50 мкл исследуемого раствора либо стандартных разведений антигена. Разведения антигена должны быть приготовлены на основе PBST, поскольку Tween-20 снижает неспецифичное связывание белковых молекул друг с другом и с поверхностью планшета. И исследуемый раствор, и стандартные разведения антигена вносят попарно (либо по 3 повторности), используя по две (три) лунки на каждое разведение белка. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Отмывка осуществляется раствором PBST 3 раза.

IV. Инкубация с антителами, конъюгированными с ферментной меткой

В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфичных антител, конъюгированных с ферментной меткой. Оптимальная концентрация конъюгированных антител как правило указывается производителем (обычно используют концентрацию 2-4 мкг/мл). Инкубация с антителами, содержащими ферментную метку, проводится в течение 30 минут при комнатной температуре и встряхивании на горизонтальном шейкере для планшетов. Отмывка осуществляется с помощью PBSТ 5-6 раз.

V. Проведение ферментативной реакции, сопровождающейся появлением окрашенного продукта

В лунки вносят по 100 мкл раствора субстрата и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном перемешивании.

VI. Остановка ферментативной реакции

Перед измерением оптической плотности проводят остановку цветной реакции с помощью 0,5 М H 2 SO 4 . В лунки с рабочим раствором ОФД после инкубации вносят по 50 мкл раствора 0,5 М серной кислоты. После этого можно сразу приступать к измерению оптической плотности.

VII. Измерение оптической плотности

Оптическая плотность раствора окрашенного продукта измеряется при λ=490 нм с использованием планшетного спектрофотометра.