Analiza IFA - šta je za šta i kako je studija? Elisa je imunoFermentacija krvi test: dekodirajući šta je reaktivnost ELISA-e.

Članak o generalnom farmakopeji

Ušao prvi put

Pravi opći farmakopoejalni članak odnosi se na način analize imunofoniranja (ELISA). IFA metoda je vrlo osjetljiva i vrlo specifična imunodiagnostička metoda, uz pomoć u kojoj se provodi kvalitativno i kvantitativno određivanje različitih tvari s svojstvima antigena, Hapten (neispravan antigen) ili antitijela. Metoda ELISA široko se koristi za dijagnosticiranje zaraznih i ne zarazne bolesti Čovjek i životinje mogu se koristiti i za potvrdu kvalitete imunobioloških lijekova (ILP).

Princip metode sastoji se u reakciji specifične interakcije antigena s antitijelom s formiranjem imunonog kompleksa i naknadnom otkrivanju dobivenog kompleksa koristeći spektrofotometrije, hemiluminozemne i druge adekvatne tehnike. Otkrivanje može biti poput ravne linije (kada sama tvar u studiju ima enzimsku aktivnost ili je označena enzimnom etiketom) i indirektno ili indirektna (kada supstanca u studiju, sa antitijevima imobilisanim u solidnom fazi inkubira sa antitijela označena enzimom). Kvalitativna analiza omogućava vam da pribavite informacije o sadržaju antigena ili antitijela u materijalu u okviru studija na principu "Jedenje /". Prilikom provođenja kvantitativne analize koncentracija antigena ili antitijela u materijalu u okviru studija određena je korištenjem rasporeda kalibracije.

Opće odredbe

IFA metoda uključuje 3 glavna faza: 1) formiranje imunološkog kompleksa "Antigen (proučavana supstanca) specifična je antitijela na njemu" ili obrnuto; 2) formiranje veze konjugata sa imunološkim kompleksom formiranim u prethodnoj fazi ili sa besplatnim vezama za vezanje (odrednice); 3) Pretvaranje podloge pod djelovanjem oznake enzima u registrirani signal kao rezultat biohemijske reakcije.

Sve metode za obavljanje enzima Imunoasaya klasificiraju se kao homogeni ili heterogeni.

Tehnike u kojima su sva 3 faze ELISA-e u rješenju, a ne postoje dodatne faze razdvajanja formiranih imunoloških kompleksa od nereagovanih komponenti između glavnih faza od nereagovanih komponenti pripadaju grupi homogenih IFA metoda. U srcu homogene elise, u pravilu koristi se, kako bi se utvrdilo niske molekularne tvari za težinu, proces inhibicije aktivnosti enzima kada je povezan sa antigenom ili antitijelom. Kao rezultat reakcije, aktivnost antitela enzima antigena obnavlja se antigena antitela. Kada se imunolovni kompleks formira antigen antigen koji sadrži enzimnu etiketu, enzimna aktivnost inhibira za 95% u odnosu na visoko molekularnu podlogu težine, koja je zbog steričnog izuzeća od supstrata iz aktivnog centra enzima. Kako se koncentracija antigena povećava, veže se sve više i više antitela, a sve više i više besplatnih konjugata antigen-enzima sačuvano je sposobnim za hidrolizaciju supstrata visoke molekularne težine. Homogena metoda IFA se vrši vrlo brzo. Analiza jedne definicije zahtijeva 1 min. Osjetljivost metode je prilično velika. S njom možete definirati supstancu na nivou vrhova.

Za heterogene metode analizu analize u dvofaznom sistemu sa sudjelovanjem solidne faze - nosača i fazi odvajanja imunoloških kompleksa od nereagovanih komponenti (pranja), koji su u različitim fazama (formirani imuni kompleksi na čvrstom Faza i nereagovani kompleksi u otopini). Heterogene metode u kojima stvaranje imunoloških kompleksa u prvom fazu teče na solidnoj fazi nazivaju se solidnim fazni metode.

Metode se odnose na homogeno-heterogena, ako je 1 korak formiranje određenih kompleksa - u rješenju, a zatim se čvrsta faza s imobiliziranim reagensom koristi za odvajanje komponenti.

Metoda heterogenog IFA sastoji se od 3 glavne faze:

• imobilizacija antigena ili antitijela na čvrstoj fazi, dobiveni kompleks naziva se imunosorbent;
• uklanjanje nevezanog reagensa i blokiranje veznih mjesta na čvrstom podlogu pomoću blokiranih proteina, kao što su albumin, kazein; Inkubacija analiziranog lijeka s imunosorbentima kako bi se pojavila;

3) Otkrivanje zbog enzimske aktivnosti najučenijeg supstancije ili zbog enzimske etikete povezane sa analiziranim lijekom (direktna verzija). U nekim su slučajevima dodatna inkubacija kompleksa "Imunosorbent proučavana supstanca" sa sekundarnim antitijelima konjugirana enzimskom etiketom (indirektna verzija).

Kvantitativno određivanje proučarene supstance vrši se dodavanjem odgovarajuće podloge za supstancu i usporedbu signala na testnu supstancu sa standardnim uzorkom.

Metoda heterogenog IFA-e podijeljena je u ne-konkurentnu elfu i konkurentnu elizu. Sheme analize mogu se izmijeniti tokom razvoja procesa. ljekovita priprema U skladu sa potrebnim zahtjevima. Promjene trebaju biti navedene u farmakopejskom članku ili regulatorna dokumentacija. Izbor metode za obavljanje Elise ovisi o prirodi proučarene supstance i njegove količine, jer različite vrste IFA imaju različitu osjetljivost. Za procjenu kvalitete tvari koje sadrže antitela, moguće je koristiti specifična antiiotypska antitijela.

Nekonkurentna metoda IFA-e

Nekonkurentna metoda IFA podijeljena je u nekoliko vrsta otkrivanja (izravna konkurentna, indirektna (indirektna) konkurentna) i prema vrsti tvari imobiliziran na čvrstoj fazi (antigena ili antitijela).

Direktna verzija IFA-e

Može se izvoditi na 2 načina. U prvom slučaju, proučavana supstanca (antigen) direktno je imobilizirana na čvrstu fazu; Tada je označena antitijela vezana antigenom detektor. Prilikom obavljanja testa, antitijelo imobilizirano antitijelo se koristi na drugačiji način. U ovom slučaju detektor je proučavana supstanca označena enzimom.

Indirektna (indirektna) verzija IFA-e

Prilikom izvođenja indirektne verzije IFA-e, antigen imobiliziran na čvrstoj fazi. Nakon blokiranja, antigenu se dodaje rješenje antitijela specifičnih za antitela. Nakon inkubacije, kompleks antigena protiv antitela oprao je iz ne-imunoglobulina (anti-IG) označenog anti-imunoglobulina (anti-ig), koji djeluje kao detektor koji enzim označava enzim. Detektori protiv IG-a komercijalno su dostupni za određene klase i potklase IG, što ovaj analiza čini pogodnim za izotyping antitela. Pored toga, upotreba označene anti-IG poboljšava signal u odnosu na izravnu metodu enzimskog analize imunode, čime se povećava osjetljivost analize.

Metoda "Sendvič" kao opcija za IFA

Najčešća nekonkurentna metoda je metoda "sendviča". Kada se izvodi na solidnoj fazi, primarna antitela sa njihovom naknadnom bravom su imobilizirana. Tada im se proučavana supstanca koja sadrži antigen dodaje ih i inkubiraju. Nakon inkubacije, kompleks antigena i antitijela ispire se iz nevezanog antigena, a sekundarna antitijela označena enzimom se dodaju i otkrivaju.

Konkurentna metoda IFA-e

Konkurentska metoda IFA-e podijeljena je u nekoliko vrsta: prema vrsti otkrivanja (izravna konkurentna, indirektna (indirektna) konkurentna) i prema vrsti supstanci imobiliziran na solidnoj fazi (antigena ili antitela).

Direktna konkurentna verzija IFA-e

Za otkrivanje ili kvantitativno određivanje Topiv antigeni primjenjuju izravnu konkurentsku verziju ELISE-a s antigenom imobilisanim na solidnoj fazi. Da biste to učinili, koristite antigela specifične za antigen konjugirana s odgovarajućim detektorom (na primjer, hruproksidazu, alkalnu fosfatazu, rutenijum ili fluorescein). Teška faza je imobilizirana standardnim antigenom sa naknadnim blokiranjem. Antitid koji se konjugira s enzimskom etiketom inkubira se sa proučavanjem (topljivim antigenom). Tada se ova smjesa dodaje u imobilirani antigen, inkubiran, a zatim se opere iz nepristranog kompleksa antigenskih antitela. Sljedeći korak je dodavanje odgovarajuće podloge za enzimsku oznaku. Inhibicija reakcije Zbog prisustva 2 antigena u sistemu, u usporedbi s upravljačkim modelom bez konkurentnog rastvorljivog antigena, obrnuto je proporcionalan vrijednosti iz količine proučarene tvari.

Implementacija izravne konkurentne procjene EIA aplikacije s antitijelom imobiliziranim antitijelom sličnim izravnim konkurentnim ELISA-om s antigenom imobiliziran na čvrstoj fazi, ali se koristi za otkrivanje ili kvantificiranje definicije antitijela.

Indirektna (indirektna) konkurentna verzija IFA

Ova metoda obavljanja ELISA-e slična je direktnoj konkurentskoj opciji, umjesto označenog antitijela ili antigena, označena anti-ig reagens koristi se ili označava sekundarna antitijela.

Opći uvjeti za provođenje metodeIFA

Različiti materijali koriste se kao čvrsta faza za analizu imunomjeranosti: silikon, nitroceluloza, poliamidi, polistiren, polivinil hlorid, polipropilen, akril i drugi. Zidovi cijevi, 96-bunari i ostale tablete, kuglice, perle, kao i nitrocelulozične i druge membrane, aktivno se narezine proteine \u200b\u200bmogu poslužiti kao čvrstu fazu. Princip imobilizacije (hidrofobna, hidrofilna, kovalentna interakcija) ovisi o izboru čvrste faze. Više od ostalih, plastična plastična plastična ploča 96 dobro se koriste kao čvrsta faza. Broj bunara u tabletu može varirati. Tablet može biti proziran (kolorimetrijsko otkrivanje) i mat (Chemiluminectcentna detekcija, fluorimetrija).

Imobilizacija se mora izvesti bez mjehurića zraka u bunaru, jer njihovo prisustvo mijenja testiranje optičke gustoće. Moguće je koristiti biotinilizirane imobilizirane reagense. U ovom slučaju se u reakciji koriste Streptavidin i biotinilirana enzimatska etiketa. Ova metoda se koristi za poboljšanje signala. Vrijeme i temperaturu imobilizacije, ovisno o kinetičkoj prirodi, stabilnosti i koncentraciji reagensa, trebaju biti naznačeni u farmakopejskom članku i regulatornu dokumentaciju.

Sve faze rješenja za analizu ruku, ispiranje i blokiranje, vremenski intervali i temperaturne uvjete za svaku fazu, broj revolucija u minuti za inkubaciju na čišćenju, uvjeti otkrivanja također bi trebali biti navedeni u farmakopejskom članku i regulatornu dokumentaciju.

Primjeri tehnika za neke vrste ELISA-e

Indirektna ne-konkurentna metoda IFA metoda

1. Antigenska sorpcija.0,1-0,5 μg antigena i 100 μl od 0,05 m od tableta od karbonata-bikarbonata (pH 9,6) izrađuju se na svakom dobrom tabletu 96-bunar, ako nema drugih indikacija u farmakopoejalnom članku ili regulatornu dokumentaciju, a zatim ponašati Sorpcija na 4 ° C 16 sati. Moguće je koristiti ostala rješenja međuspremnika sa visokim pH vrijednostima. Inkubacija se vrši prilikom tresenja na vodoravnom šejku za tablete.

Pranje (dvostruko) Neverovatni antigenski molekuli provodi fosfatno-sol pufer (PH 9.0), koji sadrži 0,1% Twin-20 (300 μl), ako u farmakopoealnom članku ili regulatornu dokumentaciju nema drugih.

1. Zaključavanje.Za blokiranje nespecifične vezivanje antigena ili antitijela, tanjir tableta ispunjene su tabletom sa fosfatnim solim (PH 9.0) ili drugom pufernom rješenju označenom u farmakopoejalnom članku ili u regulatornu dokumentaciju koja sadrži 1% rešenje govednog seruma ili albumina ili Ostali proteini (kazein, želatin, mliječni prah, itd.) I inkubiran 10-15 minuta na sobnoj temperaturi (ako nema drugih indikacija u farmakopoejalnom članku ili regulatornu dokumentaciju).

III. Titracija određenih antitijela.Ako vam je potrebna kvantitativna procjena, testna supstanca (antigen ili antitijelo) titrira se u serijskim razrjeđivanjima paralelno sa standardnim uzorkom (CO).

Titracija se može izvesti i u vodoravnom i u vertikalnim redama tableta. Treba napomenuti da se titriranje antitijela vrši ako je potrebno odabrati optimalnu koncentraciju antitijela ili odrediti njihov titar. U slučaju da se utvrđuje optimalna koncentracija i / ili antitijelo Titer, koristi se uzgoj preporučene za ove antitijele (serum).

Kada titracija, prva rupa reda čini gotov uzgoj antitijela - u prosjeku 1-10 μg po dobro, dodatno proizvede uzastopno uzgoj antitijela u bunarima. Inkubacija sa specifičnim antitelama vrši se 30 minuta na sobnoj temperaturi prilikom tresenja na vodoravnom šejku za tablete.

Operanje se vrši najmanje 3-4 puta s puferom fosfate-soli PH 9.0 koji sadrži 0,1% twin-20.

1. Dodavanje anti-video zapisa (anti-globulin) antitela konjugirana enzimnom etiketom.Poliklonalna antitijela protiv širine Kongugirana enzimskom etiketom koriste se kao detektor (sekundarna) antitijela. Najčešće koza ili zečeva antitijela, specifična za cijeli molekulu ili fc fragmente specifičnih antitijela. Koncentracija antitijela detektora, u pravilu, označava proizvođač u obliku razrjeđivanja početnog rješenja (na primjer, 1: 1000).

Inkubacija sa sekundarnim pranjem antitela vrši se 30 minuta na sobnoj temperaturi prilikom tresenja na vodoravnom šejku za tablete.

Operanje se vrši najmanje 3-4 puta uz pomoć rešenja za tampon fosfatne soli (PH 9.0) koja sadrži 0,1% Twin-20.

Inkubacija se vrši 10 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnom šejku za tablete.

1. 100 μl rješenja podloge uvedene su u bunare i inkubira 10 minuta na sobnoj temperaturi i stalnom miješanju. Da biste zaustavili enzimsku reakciju, koristi se "zaustavljanje reagensa", koji se dodaje svim proučenim i kontrolnim uzorcima u jednakim iznosima. Najčešće se sumporna kiselina koristi kao "zaustavljanje reagensa".

Direktno ne-konkurentno iFA metoda

Metoda izravnog IFA ima samo male razlike od metode indirektnog nekompektivnog elisa. Dakle, e i II faze su isti u obje vrste analize. Razlika se nalazi u činjenici da u direktnoj verziji ELISA-e u fazi III koristi specifičnu antitigod-ov antigen zamišljen za konjugirani na enzimnu etiketu, a izravno komuniciraju s tvarima u studiji. Ako je potrebno, moguće je i titrati konjugirati na isti način kao što je princip opisan ranije za ne-konjugirane antitijele. Stage IV unutar okvira izravnog nekonkurentnog IFA se ne provodi.

Metoda "sendvič" IFA

U ovoj izvedbi Elisa koristi par antitijela (primarnih i sekundarnih), specifičnih za prostorno udaljene epitopame proučavanja antigena.

1. Sorpcija antitijela na solidnoj fazi.Metoda sorpcije antigena slična je načinu sorpcije antitela u odjeljku "indirektna nekonkurentna metoda ELISA".
2. Zaključavanje.Metoda blokiranja nesetkosti obvezujućih mjesta na supstratu (solidna faza) slična je metodi blokiranja opisana u odjeljku "Indirektna ne-konkurentna IFA metoda".

III. Inkubacija sa antigenom.U bunarima, 50 μl testne tvari i standardne razrjeđenja antigena izrađuju se u bunarima unaprijed potpisanih antitijela, ako nema drugih indikacija u farmakopoejalnom članku ili regulatornu dokumentaciju. Uzgoj antigena treba pripremiti na temelju rješenja za pufer fosfate (pH 9.0) koja sadrži 0,1% twin-20, jer Twin-20 smanjuje nesedno obvezujuće molekula proteina jedna s drugom i površinom tableta. I supstanca u studiju, a standardni uzgoj antigena uvedeni su u parovima u susjedne bušotine u vodoravnom redu (bilo 3 ponavljanja), koristeći 2 (3) bušotine za svaki razrjeđivanje proteina.

Inkubacija se vrši na sobnoj temperaturi 30 minuta sa stalnom mešanjem. Pranje se vrši najmanje 3-4 puta sa tampon fosfatnim hladnjakom (pH 9.0) koji sadrži 0,1% twin-20, ili drugim pufernim rješenjem naznačenim u farmakopejskom članku ili regulatornu dokumentaciju.

1. Inkubacija sa antitelama konjugirana enzyme etiketom.U bunarima tableta uvede se 100 μl otopine specifičnih antitijela koji se povezuje sa enzimnim etiketom. Optimalna koncentracija konjugiranih antitijela, u pravilu, naznačena je u farmakopejskom članku ili regulatornu dokumentaciju (koncentracija 2-4 μg / ml obično se koristi).

Inkubacija s antitelama koja sadrži enzimnu etiketu vrši se 30 minuta na sobnoj temperaturi prilikom tresenja na vodoravnom shakeru za tablete.

Operanje se vrši najmanje 3-4 puta s pufernim rešenjem fosfate-soli (PH 9.0) koji sadrži 0,1% twin-20 ili neku drugu pufernu otopinu navedenu u farmakopejskom članku ili regulatornu dokumentaciju.

1. Enzimska reakcija popraćena izgledom obojenog proizvoda.Metoda provođenja enzimske reakcije slična je tehniku \u200b\u200bopisanoj u odjeljku: "Indirektna ne-konkurentna IFA metoda".

Detekcija

Kao što je već spomenuto, za otkrivanje koje koristi enzimska oznaka ili drugi reagens antitela. Kao enzim enzima, na primjer, može se izvesti keren peroksidaza, alkalna fosfataza ili galaktidaza. Antitela ili antigeni s drugim oznakama mogu se koristiti kao detektor. Izbor reagensa detektora ovisi o vrsti oznake konjugirane antitijelom ili antigenom i načinom otkrivanja.

Spektrofotometrija, hemilumizencija, fluorimetrija i druge metode, zasnovane na izboru etikete, mogu se koristiti kao metode otkrivanja.

Rezultati kvantitativne metode IFA-e

Rezultati kvantitativne metode ELISA izračunavaju se linearnom kalibracijskom krivuljom sa regresijom za dovod ili korištenje složene metode pomoću nelinearne kalibracijske krivulje sa obrnutom regresijom. Način tumačenja rezultata ovisi o načinu formulacije Elise. Na primjer, prema rezultatima ispitivanja pomoću krivulje kalibracije, može se procijeniti nepoznata koncentracija uzorka, procjena polu-maksimalne koncentracije inhibicije ili efikasne koncentracije. To vam omogućuje određivanje količine tvari pod proučavanjem ili njegove aktivnosti u odnosu na standardni uzorak referentnog / kalibracije (CO). Tipično vrsta krivulje kalibracije prilikom obavljanja kvantitativne metode ELISA-e, što karakteriše koncentraciju analiziranog lijeka, ovisi o izračunatoj prosječnoj vrijednosti nelinearnog. S tim u vezi, preporučuje se upotreba različitih matematičkih modela za analizu rezultirajuće krivulje. U drugim slučajevima, ELISA metoda koristi se kao kvalitativna metoda, što omogućava procijeniti prisutnost testiranja u uzorku unutar osjetljivosti tehnike.

Bilješka.

Priprema karbonatnog bikarbonatnog rešenja (ph 9,6). 1,59 g natrijum-karbonata (bezvodan) ili 4,29 g natrijum-karbonata od 10 vodenih i 2,93 g natrijum ugljikokonokokarabona donose se u mjerni cilindar 1000 ml, otopljenog u 800 ml vode pročišćenim, glasnoća otopine je Prilagođeno spremniku vode pročišćene i pomiješane ponovo.

Za sveobuhvatnu procjenu stanja tijela primjenjuje se metoda IFA metode dijagnostike. Test krvi imuloferiranja namijenjen je dijagnosticiranju zarazne, hematološke, primarne i sekundarne imunodeficijencije.

Šta je analiza IFA

Mnogi pacijenti su zainteresirani za metodu IFA: Šta je za koje se provodi studija. Imununimalna analiza počela je koristiti relativno nedavno. U početku su se antigenske strukture proučavaju s njim, a izvedeno je samo u naučne svrhe. Tada su naučnici došli do zaključka da se uz pomoć enzima mogu identificirati posebna antitijela koja nastaju kao odgovor na pojavu bolesti.

U početku se ova tehnika koristila samo uski profil medicinske ustanoveuglavnom na stanicama transfuzije krvi. Od posebnog značaja je ELISA metoda za otkrivanje HIV infekcije.

Do danas ova metoda ima širok opseg primjene. Moderne laboratorije koriste ga za dijagnosticiranje:

• tumori;
• hormonski poremećaji;
• infekcije;
• hronični ili prethodno preneseni zarazne procese;
• helmintes.

Ako se zarazni proces nastavlja u tijelu, tada se ova vrsta dijagnoze smatra najoptimalnijom za određivanje vrste bolesti.

Suština metode i njegovih vrsta

IFA metoda je ono što jest, koja je suština ove vrste studija? Ovo i mnoga druga pitanja zanimaju su pacijenti. Osnova ove metode dijagnoze je vezivanje imunološke ćelije Tijelo sa antigenima uzročnika infekcije. Rezultirajući kompleks određuje se posebnim enzimom.

Da biste razumjeli princip metode ELISA, morate znati kako je reakcija antitela antigena. Antigen je vanzemaljac za tijelo molekule proteinskog porijekla, što prodire zajedno sa infekcijom. Čestice tuđe krvi, nedosljedne s grupom, također se smatraju antigenima. U tijelu oni provociraju imunološki odgovor namijenjen zaštiti od vanzemaljskih tvari. Stoga ljudsko tijelo proizvodi antitijele - imunoglobulins koji se mogu pridružiti antigenima, formiranjem imunog kompleksa. Takvi spojevi su mnogo lakši za prepoznavanje i uništavanje ćelijama imuniteta.

Reakcija na prisustvo takvih imunoloških kompleksa vrši se u laboratorijskim uvjetima, primjenjujući gotove veze za utvrđivanje da li su u krvi poput njih.

Suština IFA metode je, međutim, sasvim jednostavna zbog činjenice da se provodi test krvi kako bi se identificiralo mnoge infekcije i bolesti, postoji nekoliko vrsta njegovih sorti. Svaka se odlikuje shemom implementacije i području aplikacija. Može biti ravno ili indirektno elisa. Direktna metoda uključuje činjenicu da se koriste imobilizirana antitijela reagiraju s antigenima. Glavna prednost ove metode je da se svi procesi mogu automatizirati, a samim tim, dijagnoza traje malo vremena.

Indirektna metoda podrazumijeva da se koriste antitela sekundarne prirode. A na solidnoj fazi je imobiliziran antigen. Analiza vam omogućava identifikaciju antitijela na različite antigene. Pomaže u postizanju preciznijeg rezultata, ali metoda karakteriše složenost.

Prednosti istraživanja

IFA metoda ima brojne prednosti u odnosu na druge dijagnostičke metode. Glavna može pripisati takvu:

• velika osetljivost;
• stabilnost prilikom skladištenja sastojaka;
• dijagnostička brzina;
• možete koristiti malu količinu materijala u studiju;
• postoji mogućnost automatizacije svih procesa;
• možete identificirati infekciju u najranijim fazama.

Ova dijagnostička metoda je univerzalna, pa je pogodna za provođenje masovnog ispitivanja. Uz pomoć analize, moguće je pratiti dinamiku zaraznog procesa.

Indikacije za analizu i ogradu

Provođenje istraživanja korištenjem IFA metode može se dodijeliti u sumnji u mnogim bolestima:

Venska krv se istražuje za antitijele. Prije analize, elementi koji mogu komplicirati studiju razlikuju se iz nje. Možda postoji ograda i druge biološke tečnosti.

Da biste dobili najtačnije informacije, u praznom stomaku se vrši krvna ograda. Ako je postupak dodijeljen za definiranje skrivene infekcije, a zatim nekoliko tjedana prije analize, potrebno je prestati uzimati antibakterijsku i antivirusni lijekovi. Ovisno o opremi laboratorije, gdje je uzet materijal, rezultat se može dobiti tokom dana. U hitni slučajevi Ovog puta se smanjuje na nekoliko sati.

Analiza na sifilisu

Upotreba IFA metode pomaže u određivanju prisutnosti mnogih infekcija u tijelu, posebno sifilis. Za studiju, krv se uzima iz Beča na prazan stomak. Tada se provodi studija kako bi se utvrdio ne samo prisustvo bolesti u tijelu, već i tačno vrijeme početka, jer za vrijeme bolesti neke antitijele zamjenjuju drugi u strogo definiranom nalogu.

U okviru akutne faze, što ukazuje na produženi tok bolesti, ili sa pogoršanjem hronične infekcije u krvi, otkriće se imunoglobulini tipa M. Prisutnost tipa Imunoglobulina ukazuje na to da infekcija stanovništvo u tijelu više od 4 Nedelja. Imunoglobulini grupe G razgovaraju o visini bolesti ili prethodno izvedene terapije.

Prema stupnju boja bunara, procjenjuje se intenzitet zaraznog procesa, jer njegova zasićenost ovisi o broju generičkih imunoloških kompleksa.

HIV analiza

IFA metoda odnosi se na analizu u ovom slučaju, ima određene značajke koje su povezane s protokom i napredovanjem bolesti. Ova metoda istraživanja smatra se najprihvatljivijom za određivanje, ali potrebno je provesti ne prije nekoliko mjesec dana nakon utjecaja faktora rizika. To je zbog prisustva period inkubacijeteče od 45 dana i do 6 meseci. Zato se analiza mora ponoviti za šest mjeseci.

• ascaridosis;
• giardiasis;
• toksoplazmoza itd.

Unatoč svim prednostima, postoje i nedostaci IFA metode. Glavni nedostatak je da je tokom studije doktor trebao imati unaprijed projekciju bolesti.

Ako nije moguće slučajno pronaći patogen i odrediti njegova svojstva imunomjerno umjesto. Test samo ukazuje na prisustvo antitela u krvi pacijenta. Pored toga, prilično je skupa analiza.

Dešifriranje analize

Rezultat visokokvalitetnog ELISA-e bit će ili prisustvo antitijela ili njihovog odsutnosti u krvi. Ako se izvrši kvantitativna analiza, koncentracija antitijela može se izraziti ili u digitalno značenje, ili u određenom broju znakova +.

Pored toga, pokazatelji se analiziraju kao:

IGM indikator označava protok akutnog zaraznog procesa u tijelu. Njegovo potpuno odsustvo može govoriti o odsustvu uzročno uzročnika bolesti ili prelaska na njega hronična inscenacija.

IGA indikator s negativnim rezultatom IGM testa ukazuje na hroničnu ili skrivenu infekciju. Istodobno prisustvo IGM-a i IGA sugeriraju da je bolest u akutnoj fazi. Prisutnost IGG-a govori o prelasku bolesti u kroničnu fazu ili potpuni oporavak i razvoj imuniteta.

Sada postoje posebni testovi ELISA-e koji se mogu provesti samostalno.

U mrežnoj laboratoriji Lab4u želimo da se svaki od vas brine o svom zdravlju. Za to jednostavno i razumijemo o performansama tijela.

U mrežnom laboratoriju Lab4u su napravljeni serološke studije Da bi se otkrili antigeni uzročnika i specifičnih antitijela, to je najtačnija metoda dijagnosticiranja zaraznih bolesti. "Zašto bih trebao preuzeti analizu antitijela za dijagnosticiranje infekcija?". Takvo se pitanje može pojaviti nakon direktora ljekara u laboratoriji. Pokušajmo odgovoriti na to.

Sadržaj

Šta je antitela? I kako dešifrirati rezultate analize?

Antitijela su proteini koji imuni sistem Proizvodi kao odgovor na prodor infekcije. U laboratorijskoj dijagnostici, to je antitela koja služe kao marker prodora infekcije. Opće pravilo pripreme za analizu antitela je doniranje krvi iz Beča na prazan stomak (nakon obroka, treba biti najmanje četiri sata). U modernoj laboratoriji serum je istražen u automatskom analizu koristeći odgovarajuće reagense. Ponekad je serološka analiza antitela jedini način za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.

Analize na infekcijama mogu biti kvalitativni (dajte odgovor ako postoji infekcija u krvi) i kvantitativni (pokažite nivo antitela u krvi). Norma antitela za svaku infekciju je vlastiti (za neke ne bi trebale biti uopšte). Referentne vrijednosti (norme norme) antitijela mogu se dobiti uz rezultat analize.
U mrežnoj laboratoriji Lab4u možete proći po isto vrijeme i

Razne klase IGG, IGM, IGA antitijela

Analiza imuneasaya određuje antitijela infekcije koja se odnose na različite klase IG (G, A, M). Antitela za virus, u prisustvu infekcije, određuju se vrlo rana fazaŠto osigurava efikasnu dijagnozu i kontrolu protoka bolesti. Najčešće metode dijagnosticiranja infekcija su testovi na antitijevima klase IGM (akutna faza protoka infekcije) i antitijela IgG klase (održivi imunitet do infekcije). Ove antitijele su određene za većinu infekcija.

Međutim, jedna od najčešćih analiza - ne razlikuje vrstu antitijela, jer je prisustvo antitijela na viruse ovih infekcija automatski predlaže hronični protok Bolesti i kontraindiciran, na primjer, za ozbiljne hirurške intervencije. Stoga je važno pobijati ili potvrditi dijagnozu.

Detaljna dijagnostika vrste i broj antitela tokom dijagnosticirane bolesti može se izvršiti predajom analize na svaku specifičnu infekciju i vrstu antitijela. Primarna infekcija se otkrije kada dijagnostički značajan nivo antitela IGM-a u uzorku krvi ili značajan porast broja IGA ili IGG antitijela u uparenim serumima snimljenim intervalima od 1-4 tjedna.

Reinfekcija ili ponovno infekcija, otkrivena je brzim porastom nivoa IGA ili IGG antitijela. Antitela IGA imaju veću koncentraciju kod starijih pacijenata i preciznije dijagnosticiraju trenutnu infekciju kod odraslih.

Prenesena infekcija u krvi definirana je kao povišena iGG antitijela Bez rasta koncentracije u uparenim uzorcima, snimljen intervalima za 2 tjedna. U ovom slučaju ne postoje antitijela klase Igm i A.

IGM antitijela

Njihova koncentracija raste ubrzo nakon bolesti. IGM antitela definiraju su već 5 dana nakon što je započeo i doseže vrhunac između jedne do četiri sedmice, a zatim se smanji za dijagnostički manje razine nekoliko mjeseci čak i bez liječenja. Međutim, za potpunu dijagnostiku nema dovoljno definicije samo klase M antitela: Nepostojanje ove klase antitijela još ne ukazuje na odsustvo bolesti. Akutni obrazac Ne postoji bolest, ali može biti hronična.

IGM antitela su od velikog značaja u dijagnostici i dječjim infekcijama (rubeola, kašalj, vjetrenjača), lako se prenosi u zrakDakle, važno je identificirati bolest što je prije moguće i izolirajući bolest.

IGG antitijela

Glavna uloga antitijela IgG-a je duga zaštita tijela iz većine bakterija i virusa - iako se njihov razvoj pojavljuje sporije, ali odgovor na antigenski poticaj održava se stabilniji od onog antitijela IgM-a.

IGG antitijele povećavaju sporije (15-20 dana nakon početka bolesti) od IgM-a, ali ostaju povišen duže, pa mogu pokazati dugogodišnju infekciju u odsustvu IgM-a. IGG može biti na niskom nivou dugi niz godina, ali, kada je preispitao istim antigenu, nivo IgG antitijela brzo se povećava.

Za kompletnu dijagnostičku sliku potrebno je istovremeno definirati IGA i IGG antitela. Sa nejasnim rezultatom IGA-e, potvrda se vrši definicom IGM-a. U slučaju pozitivnog rezultata i za tačnu dijagnostiku, druga analiza napravljena u 8-14 dana nakon prvog mora biti provjerena paralelno za određivanje rasta koncentracije IgG-a. Rezultati analize trebaju se tumačiti u kompleksu s informacijama dobivenim u drugim dijagnostičkim postupcima.

IGG antitijela, posebno koriste se za dijagnozu - jedan od uzroka čira i gastritisa.

Antitijela Iga.

Serum se pojavljuje za 10-14 dana nakon početka bolesti, a u početku se mogu čak naći u sjemenim i vaginalnim tekućinama. Nivo antitijela IGA obično se smanjuje za 2-4 mjeseca nakon infekcije u slučaju uspješnog tretmana. Kada se ponovo zaraže, nivo antitela IGA ponovo se povećava. Ako nivo IGA ne padne nakon tretmana, onda je ovo znak hronični oblik Infekcije.

Analiza na antitijelima u dijagnostici infekcija baklja

Skraćenica baklja pojavila se u 70-ima prošlog stoljeća, a sastoji se od velikih slova latino imena grupe infekcija, od kojih je karakteristična karakteristika u kojoj je riječ o relativnoj sigurnosti za djecu i odrasle za vrijeme trudnoće u nuždi Opasnost.

Često infekcija žene infekcije na kompleks baklja tokom trudnoće (prisutnost u krvi samo je IGM antitijela) pokazatelj je za njegov prekid.

Konačno

Ponekad, pronalaženje rezultata analize IgG antitela, na primjer, toksoplazmoze ili herpes, pacijenti dolaze u panika bez gledanja na činjenicu da IGM antitijela koji pokazuju postojanje trenutne infekcije mogu uopće izostati. U ovom slučaju analiza ukazuje na prethodno prenesenu infekciju na koji je imunitet razvijen.

U svakom slučaju, interpretacija rezultata analize je bolje povjeriti liječniku, a s tim, ako je potrebno, odlučiti o taktici liječenja. I možete nam povjeriti testove.

Zašto brže, ugodnije i profitabilnije za prolazak testova u lab4u?

Ne treba vam dugo da biste čekali u registraciji

Sva izvršenja i plaćanje narudžbe događa se na mreži za 2 minute.

Put do medicinskog centra ne traje više od 20 minuta

Naša druga najveća mreža u Moskvi, a mi smo u 23 gradova Rusije.

Proverite da vas ne udara

Stalni popust od 50% vrijedi na većini naših testova.

Ne morate doći minutu - u minuti ili čekate u redu

Dostava analize javlja se u prikladnom vremenskom periodu, na primjer, od 19 do 20.

Ne morate dugo čekati da sačekate rezultate ili ih idite na laboratoriju.

Poslat ćemo ih al. Poštu u trenutku spremnosti.

U dijagnozi virusnih bolesti čovjeka i životinja, metode zasnovane na korištenju enzima kao oznake antigena i antitijela široko se koriste. Ova grupa metoda naziva se enzimmu imunoasay.

Elisa se koristi u dvije verzije: histohemijsku i solidnu fazu.

Histohemijska verzija ELISA-e ili reakcije imunoperoksidaze, rijetko se koristi. Slično je metodi imunofluorescencije, ali odlikuje se činjenicom da se antitijela označena fluororom koriste za formiranje reakcije, ali enzima.

Za oznaku antitijela obično se koriste enzimi: hronična peroksidaza (češće), alkalna fosfataza, galaktozidaza itd.

Dakle, antigen + antitijelovni kompleks uključuje antitela označena enzimom, a podložna (enzimna supstanca) napravljena je za otkrivanje ovog kompleksa, koji se razgrađuje pod djelovanjem enzima, čime se formira u boji enzimske reakcije, dobro vidljiv u laganom mikroskopu.

Ortophenilendiamin, 5-aminosalcilna kiselina ili benzidina koriste se kao supstrat. Dodan je vodik peroksid (h 2 o 2).

Materijal za identifikaciju virusnih antigena s ovom varijantom može biti: razmazi; otisci različitih organa; Parafinski dijelovi; Kulture ćelija. U tom slučaju možete koristiti i direktnu i indirektnu metodu.

Direktna metoda. Fiksni lijek primjenjuje se konjugiran (antitijela na predviđeni virus koji je označen enzimom), održavaju se na 37 ° C za 1-2 sata u mokrim komori, a zatim se priprema oprana fiziolozom sa nevezanim konjugatom, osušenom u zraku, Dijagnosticirani su nekoliko kapi rješenja podloge, inkubirane 5-10 minuta i oprane sa fiziološkom otopinom. Tada se zvoni destiliranom vodom, a rezultat se uzima u obzir uz pomoć svjetlosnog mikroskopa. U pozitivnim slučajevima i.e., ako postoji antigen u materijalu u studiji ili difuziranje žuto-smeđe boje, ili smeđe-crne granule. U kontrolnim preparatima, bojenje ne otkrivaju.

Indirektna metoda. Fiksni lijek se primjenjuje sa određenim virusom specifičnim u serumu, izdržati na 37 ° C za 1-2 sata u mokrim komori, oprane fiziološke otopine, osušene u zraku i uzrokuju antiljublje serum označene u enzimu, s oznakom enzima, s oznakom enzima ° C 1-6 sati. Sledeće se postupak prati kao u direktnoj metodi.

Solidna faza povezani Imunosorbent test (TFIFA, Rama - reakcija enzimnih antitijela, Elisa - Imunosorbent imunozorbent povezane sa enzimom) u prošle godine Široko se koristi u biologiji, uključujući virulogiju. Karakteristična karakteristika metode je da je jedna od reakcijskih komponenti (antigena ili antitela) fiksirana na čvrstom nosaču. Mikropaneni polistirene, kuglice, štapovi itd. Koriste se kao nosači.

Ovu metodu može se otkriti i identificirati antigen, kao i otkrivati \u200b\u200bantitijele i odrediti njihov titar u serumu.

Postoji mnogo varijanti metode. Najčešće se izravna metoda koristi za otkrivanje antigena ("sendvič" -Method). Za to je antitela specifična protiv rupa u obliku mikropanenskih rupa u kojima se proučavaju antigen i održava se na 37 ° C 1-2 sata. Tada se mikropannela ispraću pufernim rešetkom i uvode u bunare enzim Na predviđeni antitenovi antitela, izdržati na 37 ° C 1 -2 h, oprane mikropanelama, rješenje podloge se vrši i izdržava 5-30 minuta. Reakcija se zaustavlja dodavanjem rješenja sumporne kiseline i vizualno uzimati u obzir u boji u boji eksperimentalnih i kontrolnih uzoraka ili uz pomoć spektrofotometrije. Pozitivni uzorci obojeni su od žute do narančaste-smeđe boje.

Otkrivanje i određivanje titra antitijela vrši se indirektno solidno-fazna metoda.

U velikim dijagnostičkim laboratorijama koriste se potpuno automatizirane instalacije za solidnu fazu Elisa, omogućujući vam analizu sa 1000 do 4000 uzoraka dnevno.

Prednosti ELISA: velika osetljivost; Specifičnost; Jednostavnost performansi; Potreban je minimalni broj komponenata; Potrebni su posebni uređaji; Evaluacija se može izvesti vizualno; sposobnost automatizacije, što omogućava da se prijavi za masovne studije; Serum u studiju ne zahtijeva preteprocesu. Ovo je ekspresna dijagnostička metoda, jer u roku od nekoliko sati možete dobiti odgovor.

Ako ste našli grešku, odaberite fragment teksta i kliknite Ctrl + Enter..

Najčešće u praksi, tri verzije solidne fazne imunoasaya - indirektni imunoasay, direktni imunoasijum i imunoatijum imunoasay. Razlike između ovih vrsta imuneasa su sledeće. U indirektnom utjelovljenju imuneasa, antigen je srobao antigen u prvoj fazi do površine rupa od polistirenskog tableta. Nakon uklanjanja nepovezanih antigenskih molekula dodaje se uzorak, koji sadrži antigenski antigen specifičan za antitelo. Rezultirajuće komplekse antigena antitela otkrivaju antitijele protiv vrsta konjugirane bilo kojom etiketom (Sl. 1A). U dolaznom utjelonju imunokalnog otkrivanje sorbenog antigena vrši se direktno koristeći specifične antitijele konjugirane s naljepnicom (Sl. 1B). U imunoasaju sendvič-tipa u prvoj fazi sruši se antigenom, ali antitijela specifična za testni antigen (antitela supstrata). Nakon uklanjanja ne-kontaktiranih molekula antitijela dodaje se uzorak koji sadrži antigen. Za otkrivanje rezultirajućeg kompleksa antitijela, antigen se dodaje druga antitijela specifična za drugu, prostorno daljinskom, antigenom epitop konjugirani bilo kojom etiketom (Sl. 1b). Upotreba antitijela specifična za dva različita antigena epitopama u imunoasmu vrste specifične za antigen, omogućava postizanje velike osjetljivosti i specifičnosti u određivanju antigena čak i u takvim heterogenim uzorcima kao u takvim heterogenim uzorcima.

Sl. 1. Princip indirektnog (a), direktnog (b) i imunoarijum sendvič tip (B)

Indirektna elisa (indirektna elisa)

Način indirektnog imuneasa karakteriziraju implementacija trostepenog procesa, u prvoj fazi čiji je antigen adsorbiran na posebno pripremljenoj plastici, antitijela specifična za njemu su integrirana na drugi s antigenom, a antigena -Lave antitijela konjugirana sa enzimom, što izaziva enzimsku reakciju indikatora u trećem u sustavu.. U ovoj metodi se fosidaza koristi kao enzim. Reakcija se vrši u posebnim tanjirima za 96 bunari.

I. SORPTING Antigen

U rupama tableta 96 bunar za imunoasay, antigen od 0,1-0,5 μg s iznosi u bunaru u 100 μl fosfats-soli sa puferom (PBS). Inkubacija se vrši u roku od 30 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnom šejku za tablete. Pranje (2-naklopljeno) Neverovatni molekuli antigena provodi se tampon fosfatnim hladnjakom koji sadrži 0,1% Tween-20 (PBST).

II. Zaključati

Da bi blokirali nespecifičnu vezu, bunari tableta ispunjena je PBST i inkubirana 10-15 minuta na sobnoj temperaturi.

III. Trljanje specifičnih antitijela

Trljanje se može izvesti i vodoravni i vertikalni redovi tableta. Treba napomenuti da se rastuća antitijela vrši ako je potrebno odabrati optimalnu koncentraciju antitijela ili odrediti titer. U slučaju da je definirana optimalna koncentracija i / ili antitijela Titer, zatim razblaživanje preporučeno za ove specifične antitijele.

Prilikom šipke, prva rupa šipke izrađuje se gotovim uzgojem antitijela - u prosjeku 1-10 μg u bunaru, a zatim provedite sekvencijalni uzgoj antitijela u bunarima. Inkubacija sa specifičnim antitelama vrši se u roku od 30 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnoj shakera za tablete. Pranje se vrši pomoću PBST 3 puta.

IV. Dodavanje anti-video zapisa konjugirane enzyme etiketom

Kako se koriste detektor (sekundarna) antitijela, antiljublja polikklonalna antitijela koja se konjugiraju s hrena peroksidazom. Najčešće koza ili zečeva antitijela, specifična za cijeli molekulu ili fc fragmente specifičnih antitijela. Koncentracija antitijela detektora obično je označena od strane proizvođača u obliku razrjeđivanja početnog rješenja (na primjer, 1: 1000). Inkubacija sa sekundarnim antitijelima vrši se u roku od 30 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnom šejku za tablete. Pranje se vrši pomoću PBST 5-6 puta.

Hranska peroksidaza katalizira reakciju oksidacije podloge od hidrogen peroksida. Kao supstrat, Hren Peroksidaza koristi O-fenilendiamine (OFD). Kao rezultat prolaska reakcije formiran je oslikani proizvod oksidacije proizvoda.

Rješenje podloge: do 10 ml supstratnih međuspremnika (0,1 m na-citratni međuspremnik, pH 4,5) Dodajte 0,01 ml od 30% hidrogen peroksida i 0,2 ml 50x PFD rješenja (340 mg od 10 ml etil alkohola; trgovina na -20 ° C).

Inkubacija se vrši u roku od 10 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnom šejku za tablete.

V. Stop enzimska reakcija

VI. Mjerenje optičke gustoće

Direktno Elisa (direktna ELISA)

Metoda izravnog imunoasaya ima samo male razlike u odnosu na metodu indirektnog imunoasaya. Dakle, faze I i II su isti u obje vrste analize. Razlika se nalazi u činjenici da se u direktnoj izvedbi Imunoasaya u fazi III koriste posebna antitijela koja se konjugiraju enzimnom etiketom. Ako je potrebno, moguće je i proizvesti određene antitijele konjugirane sa enzimnom etiketom, slično kao i prethodno opisanim za ne-konjugirane antitijele. Stage IV se spušta, a daljnje faze (V-V - vii) vrše se slično na gore opisano u indirektnoj verziji imunoasaya.

Immunoasay tipa sendviča (sendvič impunoasay)

Sl. 2. Shematski prikaz Imunoasay "Sendvič" -Tip. ATP - antitijelo, ATD - Detektor Antitijelo, AG - Antigen, M je oznaka, kovalentno povezana s antitijelom detektora, p - podlozi na koji je sortiranje supstrata.

U ovoj izložbi, imunoasay (Sl. 2) koristi par antitijela specifične za prostorno udaljene epitopame testnog antigena.

I. SORPIONA ANTIBODE SUPTRTE

U rupama tableta 96-bunara za imunoasay sorbitiraju antitijela supstrata 1-2 μg u bunaru u 100 μl međuspremnika soli fosfata (PBS). Inkubacija se vrši u roku od 30 minuta na sobnoj temperaturi i trese se na vodoravnom šejku za tablete. Operanje (2-naklopljeno) nevezanih molekula antigena vrši se tampon fosfativnom i soli koji sadrži 0,1% između-20 (PBST).

II. Zaključati

Da bi blokirali nespecifičnu obvezujuća mjesta, bunari tableta napuni se PBST i inkubira se 10-15 minuta na sobnoj temperaturi.

III. Inkubacija sa antigenom

U bunarima, 50 μl ispitanog rješenja ili standardnih razrjeđivanja antigena izrađene su u bunarima plaketa s prednapreždnim antitijelima. Uzgoj antigena treba pripremiti na temelju PBST-a, jer između dva 20 smanjuje nespecifičnu vezivanje molekula proteina jedan s drugom i površinom tableta. I studirano rješenje i standardna razrjeđenja antigena dodaju se u parovima (bilo 3 ponavljanja) pomoću dva (tri) bušotine za svaki razrjeđivanje proteina. Inkubacija se vrši na sobnoj temperaturi 30 minuta sa stalnom mešanjem. Pranje se vrši s otopinom PBST 3 puta.

IV. Inkubacija sa antitijelima konjugirana enzimnom etiketom

U bunarima tableta uvede se 100 μl otopine specifičnih antitijela koji se povezuje sa enzimnim etiketom. Optimalna koncentracija konjugiranih antitijela obično označava proizvođač (obično se koristi koncentracija 2-4 μg / ml). Inkubacija sa antitelama koja sadrži enzimnu etiketu vrši se 30 minuta na sobnoj temperaturi i tresenjem na vodoravnom šejku za tablete. Pranje se vrši pomoću PBST 5-6 puta.

V. Provođenje enzimske reakcije popraćene izgledom obojenog proizvoda.

100 μl rješenja podloge uvedene su u bunare i inkubira 10 minuta na sobnoj temperaturi i stalnom miješanju.

VI. Zaustavite enzimsku reakciju

Prije mjerenja optičke gustoće, reakcija u boji zaustavlja se sa 0,5 m H 2 SO 4. U bunarima s radnom otopinom OFD-a nakon inkubacije, izrađuje se 50 μl rješenja 0,5 m sumporne kiseline. Nakon toga odmah možete početi mjeriti optičku gustinu.

VII. Mjerenje optičke gustoće

Optička gustina otopine obojenog proizvoda mjeri se na λ \u003d 490 nm pomoću spektrofotometra tableta.